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透析袋實驗中常見的20個經典問題總結

點擊次數:2565  日期:2018/7/17 13:46:13

透析袋在使用過程中會有很多疑問,我們將介紹如下問題及解答。
1問:如何準備透析膜管?

答:透析膜管的準備因膜管材質和生產工藝的差別而有所不同。注意,我們不推薦煮沸處理,因其可能損壞膜管并改變膜孔徑。
A)生物技術級RC、CE及PVDF膜可以用DI水沖洗15-30分鐘,去除防腐劑疊氮化鈉。
B)7標準級RC膜已經預處理,去除了重金屬和硫化物,只需在去離子水中浸泡15-30分鐘,去除疊氮化鈉即可。
C)1-6標準級RC膜,一般情況下,在水中漂洗足以去除甘油或防腐劑,而對于親和研究之類極其敏感的透析應用或者重金屬及硫化物會影響透析樣品下游分析的應用,可能需要一些額外的處理以去除在生產過程中引入的痕量水平重金屬及硫化物,我們提供兩種膜預處理溶液:重金屬漂洗液及硫化物清除液。
2問:透析的原理是什么?一般需要多長時間才能完成?
答:透析是指溶質在濃度梯度的驅使下,選擇性擴散通過半透膜,從而達到大/小分子分離,膜兩側濃度平衡,即小顆粒的溶質通過膜,而大分子物質不能通過,被截留在膜另一邊。如果將樣品置于透析膜管內,通過置換膜管外部的透析緩沖液,可將小顆粒物質清除,從而達到純化大分子物質的目的。一般來說,一天之內置換3-5次緩沖液,然后在室溫條件下,放在攪拌臺上隔夜透析,即可達到高效的透析結果。標準的透析操作一般需要16-24小時。許多因素會影響透析效率,包括:擴散系數、pH值、溫度、時間、物質濃度、樣品體積、透析緩沖液體積、透析緩沖液的置換次數、膜表面積、膜厚度、分子帶電荷及緩沖液攪拌速率。
透析實驗原理圖透析實驗原理
3問:透析一個樣品需要多少體積的透析緩沖液?緩沖液置換頻率怎么安排?
答:透析緩沖液的體積越大,小分子擴散的驅動力越大。我們一般推薦緩沖液和樣品的體積比為100:1。當擴散速率降低,膜兩側溶液趨于平衡時,通過置換緩沖液,可維持小分子擴散驅動力和透析速率。我們一般推薦在12-24小時內,置換緩沖液2到3次,具體安排如下:
第一次緩沖液置換:透析開始后2-3小時
第二次緩沖液置換:透析開始后4-5小時
最后一次緩沖液置換:透析隔夜之前
4問:如何選擇正確的截留分子量(MWCO)?
答:截留分子量應該竟可能的大,以使透析速率最大化。但是,為了獲得最大的樣品回收率,選擇的截留分子量應至少為需純化的大分子物質分子量的一半。對于需對幾種分子進行分離的應用,分子之間的分子量差至少為5倍,才能完成有效的膜透析。若不能滿足分子量差的要求,可能需要使用其它的分離技術,如色譜方法或切向流過濾。
選擇正確的截留分子量截留分子量
5問:那種膜的蛋白質結合率最低?
答:每種膜對不同的分子具有不同的親和性。對于球狀蛋白,相對的結合親和性由低到高為CE
6問:怎樣為膜管選擇合適大小的膜夾?
答:標準RC膜(Spectra/Por1-7)和生物技術級RC膜由柔韌的再生纖維素聚合物制造,可使用任何一種透析膜夾密封。生物技術級CE&PVDF膜由相對剛性的聚合物制造,需要使用相對溫和的通用膜夾。鑒于通用膜夾對于所有類型的膜管都能起到很好的密封作用,如不確定選擇哪種膜夾合適,使用通用膜夾即可。標準膜夾一般只用于標準級RC膜管。
膜夾的密封寬度一般需比膜管的扁平寬度長4-10mm。通用膜夾的最小密封寬度為50mm。對于所有扁平寬度規格的生物技術級膜管,均有相應的膜夾可供選擇。
7問:透析膜的保存時間為多長?
答:干包裝的透析膜可保存5年。濕包裝的透析膜(0.1%的疊氮化鈉溶液)保存期限為3年。輻照滅菌的透析膜可保存1.5年。
干型透析袋圖片干型透析袋圖片
8問:透析膜變干或凍存之后是否仍可使用?
答:濕潤的透析膜變干之后,孔徑受到不可逆的影響,膜變得脆弱易碎,容易泄露,不推薦繼續使用。透析膜凍存之后,冰晶會使膜破裂,導致泄露,此時不推薦使用該膜。
9問:透析膜完全不含內毒素嗎?
答:我們確認所有透析膜不含有內毒素,符合普通實驗室使用規格要求。
問:我需要擔心透析膜上的皺紋、滾痕或折線嗎?
答:只要膜是完整的,滾痕或者折線不會影響膜的擴散特性。
11問:CE膜比RC膜更具剛性,且不透明嗎?
答:纖維素酯(CE)膜內的聚合物交聯形成相對剛性的晶格,而再生纖維素(RC)聚合物形成更加柔韌的網格結構。不透明性是由網格中孔眼的大小所決定的,孔眼越大,膜越不透明。
12問:透析膜可以化學密封或熱密封嗎?
答:CE和RC透析膜只能機械密封,但PVDF透析膜可以機械密封或熱密封,通常用于樣品“封裝”目的。
13問:處理相同的蛋白樣品,Spectra/Por○R透析膜可重復使用嗎?
答:我們不推薦重復使用透析膜,因為特定的處理操作可能會對膜造成污染,一定的透析條件(pH值、溫度、化學接觸等)也會對膜的完整性造成損害,和/或導致泄漏,特別是在打開和重新夾上膜夾時。
14問:膜孔徑有多精確,什么是MWCO?
答:透析膜微觀下呈海綿狀結構,因此,更適合通過評定其截留性能來間接地定義“孔徑”,亦即“截留分子量”(MolecularWeightCutOff,MWCO)。MWCO定義為在17個小時內,膜截留率為90%的溶質分子量。基于此定義,選擇透析膜時,MWCO應小于需要截留的分子的大小。
15問:透析膜Spectra/Por○R2和4有什么區別?
答:Spectra/Por○R2和4都有12-14kD的截留分子量。Spectra/Por○R透析膜更適合溫和透析,Spectra/Por○R2可提供特定的更大和更小的扁平寬度,和/或滲透性;也就是說,Spectra/Por○R2的水滲透性比Spectra/Por○R4更優越。
16問:關于膜表面積和樣品量之間的關系有沒有經驗法則?
答:表面積與體積的比值取決于膜管扁平寬度。如果有兩段相同長度的膜管,扁平寬度較小的膜管具有較高的比表面積,而扁平寬度較大的膜管比表面積相對較小,也就是說,前者的透析速率更快。原因是扁平寬度較小的膜管,溶質的擴散距離較短,溶質之間通過膜孔的競爭也較小。而扁平寬度大,亦即溶質到達膜表面的距離也較長,溶質之間對膜孔的競爭也較大。一般而言,比表面積越大,透析越快。
17問:如果膜兩側的摩爾滲透壓濃度相等,但濃度梯度仍然存在,物質的通過效率如何?
答:大多數透析結束時膜兩側滲透壓相同。透析過程是由膜管內外兩側的濃度梯度驅動的。如果滲透壓力有很大的差別,水會通過膜以平衡膜兩側的滲透壓。如果過多的水通過膜,透析膜管可能會隨水運動的方向增大或縮小,在體積增加到一定程度時,有可能導致膜夾松動或膜管破裂。
透析袋夾子圖片透析袋夾子圖片
18問:進行超濾時,透析膜能承受多大的壓力?
答:透析膜設計不適合用于壓力過濾。在不影響截留分子量的前提下,最大推薦壓力為1.5psi。
19問:一般推薦使用哪種透析液(緩沖液)?
答:生物分子必須保存在嚴格的pH值控制條件下,以穩定其分子極性。典型的透析緩沖液pH范圍為6-8。以下為常用的幾種可以作為緩沖液的生化溶液:水,PBS,TBS,HEPES,氨基酸緩沖液。
20問:為什么使用微米vs道爾頓(MW)單位,怎么轉換?
答:溶解的分子大小以分子量來定義,單位為道爾頓,而顆粒和細胞大小常以直徑來定義,由于分子的結構和形態不同,相同分子量的物質,分子大小和形態可能相差較大,兩者之間沒有精確的對應關系。出于這個原因,許多常見的生物材料都已特別定性,并將大約的尺寸標注在轉換表上作為估算的參考,以用于透析、超濾和微濾應用。道爾頓與微米單位之間的轉化,請參考“孔徑表”。
21問:對于鹽濃度較高的樣品,最佳的透析方法是什么?
答:如果可能,我們推薦使用低鹽濃度的緩沖液。不推薦直接使用純DI水作為緩沖液,因為滲透壓力可能將水引入膜管,使樣品體積膨脹并可能導致膜管破裂。使用一系列濃度逐漸降低的溶液作為緩沖液可防止滲透壓力導致的膜管膨脹。每次緩沖液置換,可將溶質濃度降低十分之一,也就是說,透析一個5MNaCl的樣品,可使用500mMNaCl的緩沖液。
22問:可以使用繩子結扎膜管,而不使用膜夾嗎?
答:我們不推薦使用繩子結扎膜管。因為繩結對膜管的損害具有很大的不確定性,并且可能不能提供有效的密封,而導致泄露。只有膜夾才能提供足夠的密封性,從而保護樣品。
23問:透析膜管應該剪多長?
答:對于每種膜管扁平寬度,我們提供相關的容積/長度比,可方便計算透析樣品所需的膜管長度。如果扁平寬度為16mm,容積/長度比為0.79ml/cm,要容納5ml的樣品,則需要大約6.5cm長的膜管。但是,為保持樣品漂浮,一般需要在頂部空間預留10-20%膜長(約為1cm)。此外,也需在兩端為膜夾各預留2cm。所以總的膜管長度應至少為11.5cm。可根據以下公式計算膜管長度:總長度=(樣品體積)/(容積/長度)+(額外的10-20%)+4cm,瀏覽網頁,使用透析膜管計算器,根據樣品體積和扁平寬度,計算所需的膜管長度。
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